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                      最新消息-News

                      藥典微生物限度檢查法

                      【打印頁面】發布時間:2022-03-30 文章來源:洛肯

                      藥典微生物限度檢查法

                      中國藥典微生物限度檢查法,為《中國藥典》附錄收載的關于藥品微生物檢查的法定方法。檢查項目包括細菌數、霉菌數、酵母菌數及控制菌檢查。

                      相關介紹

                      《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)微生物限度檢查法為《中國藥典》附錄收載的關于藥品微生物檢查的法定方法?!吨袊幍洹肺⑸锵薅葯z查法系檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細菌數、霉菌數、酵母菌數及控制菌檢查?!吨袊幍洹?/span>2010版一部、二部、三部附錄的微生物限度檢查法相同?!吨袊幍洹?010版第一增補本附錄對此方法無修改,第二、第三增補本對此方法有修改,中國藥典委員會尚未正式發布。

                      任何違反《藥品生產質量管理規范》(GMP)或有未經批準添加物質所生產的藥品,即使符合《中國藥典》或按照《中國藥典》沒有檢出其添加物質或相關物質,亦不能認為其符合規定。

                      《中國藥典》2010版一部、二部、三部附錄的微生物限度檢查法內容無差別,故此文方法,以《中國藥典》2010版二部附錄ⅪJ為例。

                      微生物限度檢查應在環境潔凈度10000 級下的局部潔凈度100 級的單向流空氣區域內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作,防止再污染。單向流空氣區域、工作臺面及環境應定期按《醫藥工業潔凈室(區)懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔凈度驗證。

                      供試品檢查時,如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑,應證明其有效性及對微生物無毒性。

                      除另有規定外,本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為30℃~35℃;霉菌、酵母菌培養溫度為23℃~28℃。

                      檢驗結果以1g、1ml、10g、10ml、10c㎡ 為單位報告,特殊品種可以最小包裝單位報告。

                      注:《醫藥工業潔凈室(區)懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準分為

                      GB/T16292-2010 醫藥工業潔凈室(區)懸浮粒子的測試方法

                      GB/T16293-2010 醫藥工業潔凈室(區)浮游菌的測試方法

                      GB/T16294-2010 醫藥工業潔凈室(區)沉降菌的測試方法

                      檢驗量

                      檢驗量即一次試驗所用的供試品量(g、ml或cm2)。

                      除另有規定外,一般供試品的檢驗量為10g或10ml;膜劑100cm2;貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品,其檢驗量應增加20g或20ml(其中10g或10ml用于陽性對照試驗)。

                      檢驗時,應從2個以上最小包裝單位中抽取供試品,膜劑還不得少于4片。

                      一般應隨機抽取不少于檢驗用量(兩個以上最小包裝單位)的3倍最供試品。

                      供試液的制備

                      根據供試品的理化特性與生物學特性,采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時,應均勻加熱,且溫度不應超過45℃。供試液從制備至加入檢驗用培養基,不得超過1小時。

                      除另有規定外,常用的供試液制備方法如下。

                      1.液體供試品

                      取供試品10ml,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,混勻,作為1:10的供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。

                      2.固體、半固體或黏稠性供試品

                      取供試品10g,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,用勻漿儀或其他適宜的方法,混勻,作為1:10的供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80,并置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。

                      3.需用特殊方法制備供試液的供試品

                      1)非水溶性供試品

                      方法1 取供試品5g(或5ml ),加至含溶化的(溫度不超過45℃)5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中,用無菌玻棒攪拌成團后,慢慢加人45 ℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,邊加邊攪拌,使供試品充分乳化,作為1:20的供試液。

                      方法2 取供試品10g,加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯(制法見附錄XII A無菌檢查法中供試品的無菌檢查項下)和無菌玻璃珠的適宜容器中.必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量,充分振搖,使供試品溶解。然后加入45 ℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml,振搖5~10分鐘,萃取,靜置使油水明顯分層,取其水層作為1:10的供試液。

                      2)膜劑供試品

                      取供試品100cm2,剪碎,加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml(必要時可增加稀釋液),浸泡,振搖,作為1:10的供試液。

                      3)腸溶及結腸溶制劑供試品

                      取供試品10g,加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液(用于腸溶制劑)或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液(用于結腸溶制劑)至100ml,置45 ℃水浴中,振搖,使溶解,作為1 :10的供試液。

                      4)氣霧劑、噴霧劑供試品

                      取規定量供試品,置冰凍室冷凍約1小時,取出,迅速消毒供試品開啟部位,用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔,放至室溫,并輕輕轉動容器,使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液,加至適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(若含非水溶性成分,加適覺的無菌聚山梨酯80)中,混勻,取相當于10g或10ml的供試品,再稀釋成1:10的供試液。

                      5)貼劑供試品

                      取規定量供試品,去掉貼劑的保護層,放置在無菌玻璃或塑料片上,粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料(如無菌紗布)覆蓋貼劑的粘貼面,以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑(如聚山梨酯80或卵磷脂)的稀釋劑中,用力振蕩至少30分鐘,制成供試液。貼劑也可采用其他適宜的方法制備成供試液。

                      6)具抑菌活性的供試品

                      當供試品有抑菌活性時,采用下列方法進行處理,以消除供試液的抑菌活性,再依法檢查。常用的方法如下。

                      ①培養基稀釋法取規定量的供試液,至較大量的培養基中,使單位體積內的供試品含量減少,至不含抑菌作用。測定細菌、霉菌及酵母菌的菌數時,取同稀釋級的供試液2ml,每1ml供試液可等量分注多個平皿,傾注瓊脂培養基,混勻,凝固,培養,計數。每1ml供試液所注的平皿中生長的菌落數之和即為1ml的菌落數,計算每1ml供試液的平均菌落數,按平皿法計數規則報告菌數;控制菌檢查時,可加大增菌培養基的用量。

                      ②離心沉淀法取一定量的供試液,500轉/分鐘離心3分鐘,取全部上清液混合。用于細菌檢查。

                      ③薄膜過濾法見細菌、霉菌及酵母菌計數項下的薄膜過濾”。

                      ④中和法凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品,可用適宜的中和劑滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養基中。

                       

                      計數

                      適用性檢查

                      細菌、霉菌及酵母菌計數用的培養基應進行培養基的適用性檢查,成品培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應檢查。

                      菌種

                      試驗用菌株的傳代次數不得超過5代(從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代),并采用適宜的菌種保藏技術進行保存,以保證試驗菌株的生物學特性。

                      大腸埃希菌(Escherichia coli[CMCC ( B ) 44l02]

                      金黃色葡萄球菌StapHylococcus aureus)[ CMCC ( B ) 26003 ]

                      枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ) [ CMCC ( B ) 63501 ]

                      白色念珠菌Candida albicans)〔CMCC ( F ) 98001〕

                      黑曲霉Aspergillus niger) [ CMCC ( F ) 98003 ]

                      菌液制備

                      接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上,培養18~24小時;接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上,培養24~48小時。上述培養物用0 . 9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含菌數為50~100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上,培養5~7天,加人3~5ml含0.05 % ( ml /ml)聚山梨酯800.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然后,采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內,用含0.05 % ( ml / ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含孢子數50~100cfu的孢子懸液。

                      菌液制備后若在室溫下放置,應在2小時內使用;若保存在2~8 ℃,可在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2~8 ℃,在驗證過的貯存期內使用。

                      適用性檢查

                      取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各50~100cfu,分別注入無菌平皿中,立即傾注營養瓊脂培養基,每株試驗菌平行制備2個平皿,混勻,凝固,置30~35 ℃培養48小時,計數;取白色念珠菌、黑曲霉各50~100cfu,分別注入無菌平皿中,立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基,每株試驗菌平行制備2個平皿,混勻,凝固,置23~28 ℃培養72小時,計數;取白色念珠菌50~100cfu,注入無菌平皿中,立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基.平行制備2個平皿,混勻,凝固,置23~28 ℃培養72小時,計數。同時,用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。

                      結果判定

                      若被檢培養基上的菌落平均數不小于對照培養基上的菌落平均數的70 %,且菌落形態大小與對照培養基上的菌落一致,判該培養基的適用性檢查符合規定。

                      方法的驗證

                      當建立產品的微生物限度檢查法時,應進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證,以確認所采用的方法適合于該產品的細菌、霉菌及酵母菌數的測定。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時,計數方法應重新驗證。

                      驗證時,按供試液的制備和細菌、霉菌及酵母菌計數所規定的方法及下列要求進行。對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證。

                      菌種及菌液制備

                      同計數培養鑒的適用性檢查。

                      驗證方法

                      驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗,并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。

                      ( l )試驗組平皿法計數時,取試驗可能用的最低稀釋級供試液lml和50~100cfu試驗菌,分別注人平皿中,立即傾注瓊脂培養基,每株試驗菌平行制備2個平皿,按平皿法測定其菌數。薄膜過濾法計數時,取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液,過濾,沖洗,在最后一次的沖洗液中加人50~100cfu試驗菌,過濾,按薄膜過濾法測定其菌數。

                      ( 2 )菌液組測定所加的試驗菌數。

                      ( 3 )供試品對照組取規定量供試液,按菌落計數方法測定供試品本底菌數。

                      ( 4 )稀釋劑對照組若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時,應增加稀釋劑對照組,以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時,可用相應的稀釋液替代供試品,加入試驗菌,使最終菌濃度為每lml供試液含50~100cfu,按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。

                      結果判斷

                      3次獨立的平行試驗中,稀釋劑對照組的菌數回收率(稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率)應均不低于70 %。若試驗組的菌數回收率(試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率)均不低于70%,照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數;若任一次試驗中試驗組的菌數回收率低于70 %,應采用培養基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法(常見干擾物的中和劑或滅活方法見表1)等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,并重新進行方法驗證。

                      l 常見干擾物的中和劑或滅活方法

                      干擾物

                      可選用的中和劑或滅活方法

                      戊二醛

                      亞硫酸氫鈉

                      酚類、乙醇、吸附物

                      稀釋法

                      醛類

                      稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽

                      季銨類化合物(QACs)、對羥基苯甲酸酯

                      卵磷脂、聚山梨酯

                      汞類制劑

                      亞硫酸氫鈉、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽

                      雙胍類化合物

                      卵磷脂

                      碘酒、洗必泰

                      聚山梨酯

                      鹵化物

                      硫代硫酸鹽

                      乙二胺四乙酸(EDTA )

                      鎂或鈣離子

                      磺胺類

                      對氨基苯甲酸

                      β-內酰胺類抗生素

                      β-內酰胺酶

                      若沒有適宜的方法消除供試品的抑菌活性,那么驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的,同時表明該供試品不能被試驗菌污染。但是,供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑制作用,而對其他菌株沒有抑制作用。因此,根據供試品須符合的微生物限度標準和菌數報告規則,在不影響檢驗結果判斷的前提下,應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求,應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗。

                      計數方法驗證時,采用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求,那么選擇回收率最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗。

                      驗證試驗也可與供試品的細菌、霉菌及酵母菌計數同時進行。

                      供試品檢查

                      計數方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時,按已驗證的計數方法進行供試品的細菌、霉菌及酵母菌菌數的測定。

                      按計數方法的驗證試驗確認的程序進行供試液制備。用稀釋液稀釋成1:10、1:l02、l:103等稀釋級的供試液。

                      平皿法

                      根據菌數報告規則取相應稀釋級的供試液1ml,置直徑90mm的無菌平皿中,注人15~20ml溫度不超過45 ℃的溶化的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基,混勻,凝固,倒置培養。每稀釋級每種培養基至少制備2個平板。

                      陰性對照試驗

                      取試驗用的稀釋液1ml,置無菌平皿中.注入培養基,凝固,倒置培養。每種計數用的培養基各制備2個平板,均不得有菌生長。

                      培養和計數

                      除另有規定外,細菌培養3天,霉菌、酵母菌培養5天,逐日觀察菌落生長情況,點計菌落數,必要時,可適當延長培養時間至7天進行菌落計數并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數。點計菌落數后,計算各稀釋級供試液的平均菌落數,按菌數報告規則報告菌數。若同稀釋級兩個平板的菌落平均數不小于15.則兩個平板的菌落數不能相差l倍或以上。

                      一般營養瓊脂培養基用于細菌計數;玫瑰紅鈉瓊脂培養基用于霉菌及酵母菌計數;酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基用于酵母菌計數。在特殊情況下.若營養瓊脂培養基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養基上長有細菌,則應分別點計霉菌和酵母菌、細菌菌落數。然后將營養瓊脂培養基上的霉菌和酵母菌數或玫瑰紅鈉瓊脂培養基上的細菌數,與玫瑰紅鈉瓊脂培養基中的霉菌和酵母菌數或營養瓊脂培養基中的細菌數進行比較,以菌落數高的培養基中的菌數為計數結果。

                      含蜂蜜、王漿的液體制劑,用玫瑰紅鈉瓊脂培養基測定霉菌數,用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基測定酵母菌數,合并計數。

                      菌數報告規則

                      細菌、酵母菌宜選取平均菌落數小于300cfu、霉菌宜選取平均菌落數小于100cfu的稀釋級,作為菌數報告(取兩位有效數字)的依據。以最高的平均菌落數乘以稀釋倍數的值報告1g、lml或10cm2供試品中所含的菌數。

                      如各稀釋級的平板均無菌落生長,或僅最低稀釋級的平板有菌落生長,但平均菌落數小于1時,以<1乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。

                      薄膜過濾法

                      采用薄膜過濾法,濾膜孔徑應不大于0.45μm,直徑一般為50mm,若采用其他直徑的濾膜.沖洗量應進行相應的調整。選擇濾膜材質時應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時,應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和濾器在使用前應充分干燥。為發揮濾膜的最大過濾效率,應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量為100ml??倹_洗量不得超過1000ml., 以避免濾膜上的微生物受損傷。

                      取相當于每張濾膜lg、lml或10cm2供試品的供試液,加至適量的稀釋劑中,混勻,過濾。若供試品每1g、lml或10cm2所含的菌數較多時,可取適宜稀釋級的供試液lml進行試驗。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜,沖洗方法和沖洗量同“計數方法的驗證”。沖洗后取出濾膜,菌面朝上貼于營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基平板上培養。每種培養基至少制備一張濾膜。

                      陰性對照試驗

                      取試驗用的稀釋液lml,照上述薄膜過濾法操作,作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。

                      培養和計數

                      培養條件和計數方法同平皿法,每片濾膜上的菌落數應不超過100cfu。

                      菌數報告規則

                      以相當于1g、lml或10cm2供試品的菌落數報告菌數;若濾膜上無菌落生長,以<1報告菌數(每張濾膜過濾1g、lml或10cm2供試品),或稀釋倍數的值報告菌數。

                      控制菌檢查

                      適用性檢查

                      控制菌檢查用的培養基應進行培養基的適用性檢查,成品培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應檢查。

                      菌種

                      對試驗菌種的要求同計數培養基的適用性檢查。

                      大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC ( B ) 44l02]

                      金黃色葡萄球菌StapHylococcus aureus)[ CMCC ( B ) 26003 ]

                      乙型副傷寒沙門菌Salmonella paratypHi B )〔CMCC ( B ) 50094〕

                      銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC ( B ) 10104〕

                      生孢梭菌Clostridium sporogenes ) [ CMCC ( B ) 6494l]

                      白色念珠菌Candida albicans)〔CMCC ( F ) 98001〕

                      菌液制備

                      接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上,生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中,培養18~24小時;接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上,培養24~48小時。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含菌數為10~100cfu的菌懸液。

                      菌懸液在室溫下放置應在2小時內使用.若保存在2~8 ℃可在24小時內使用。

                      適用性檢查

                      控制菌檢查用培養基的適用性檢查項目包括促生長能力、抑制能力及指示能力的檢查。各培養基的檢測項目及所用菌株見表2。

                      2 控制菌檢查用培養基的促生長能力、抑制能力及指示能力檢查

                      控制菌檢查

                      培養基

                      特性

                      試驗菌株

                      大腸埃希菌

                      膽鹽乳糖培養基

                      促生長能力

                      大腸埃希菌

                       

                      抑制能力

                      金黃色葡萄球菌

                      4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基

                      促生長能力+指示能力

                      大腸埃希菌

                      曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基

                      促生長能力+指示能力

                      大腸埃希菌

                      大腸菌群

                      乳糖膽鹽發酵培養基

                      促生長能力

                      大腸埃希菌

                       

                      抑制能力

                      金黃色葡萄球菌

                      乳糖發酵培養基

                      促生長能力+指示能力

                      大腸埃希菌

                      曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基

                      促生長能力+指示能力

                      大腸埃希菌

                      沙門菌

                      營養肉湯培養基

                      促生長能力

                      乙型副傷寒沙門菌

                      四硫磺酸鈉亮綠培養基

                      促生長能力

                      乙型副傷寒沙門菌

                       

                      抑制能力

                      金黃色葡萄球菌

                      膽鹽硫乳瓊脂培養基或沙門、志賀菌屬瓊脂培養基

                      促生長能力+指示能力

                      乙型副傷寒沙門菌

                      曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基

                      促生長能力+指示能力

                      乙型副傷寒沙門菌

                      三糖鐵瓊脂培養基

                      指示能力

                      乙型副傷寒沙門菌

                      銅綠假單胞菌

                      膽鹽乳糖培養基

                      促生長能力

                      銅綠假單胞菌

                       

                      抑制能力

                      金黃色葡萄球菌

                      溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基

                      促生長能力

                      銅綠假單胞菌

                       

                      抑制能力

                      大腸埃希菌

                      綠膿菌素測定用培養基

                      促生長能力+指示能力

                      銅綠假單胞菌

                      金黃色葡萄球菌

                      亞碲酸鹽肉湯培養基

                      促生長能力

                      金黃色葡萄球菌

                       

                      抑制能力

                      大腸埃希菌

                      卵黃氯化鈉瓊脂培養基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養基

                      促生長能力

                      金黃色葡萄球菌

                       

                      抑制能力

                      大腸埃希菌

                      梭菌

                      梭菌增菌培養基

                      促生長能力

                      生孢梭菌

                      哥倫比亞瓊脂培養基

                      促生長能力

                      生孢梭菌

                      白色念珠菌

                      沙氏葡萄糖液體培養基

                      促生長能力

                      白色念珠菌

                      沙氏葡萄糖瓊脂培養基

                      促生長能力+指示能力

                      白色念珠菌

                      念珠菌顯色培養基

                      促生長能力+指示能力

                      白色念珠菌

                       

                      抑制能力

                      大腸埃希菌

                      1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基

                      促生長能力+指示能力

                      白色念珠菌

                      液體培養基促生長能力檢查

                      分別接種不大于100cfu的試驗菌(表2) 于被檢培養基和對照培養基中,在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養。與對照培養基管比較,被檢培養基管試驗菌應生長良好。

                      固體培養墓促生長能力檢查

                      取試驗菌各0.1ml(含菌數50~100cfu)分別涂布于被檢培養基和對照培養基平板上,在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養。被檢培養基與對照培養基上生長的菌落大小、形態特征應一致。

                      培養基抑制能力檢查

                      接種不少于100cfu的試驗菌(表2)于被檢培養基中,在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最長時間下培養,試驗菌應不得生長。

                      固體培養基指示能力檢查

                      取試驗菌各0.1ml(含菌數不大于100cfu )(表2)分別涂布于被檢培養基和對照培養基平板上,在相應控制菌檢查規定的培養溫度及時間下培養。被檢培養基上試驗菌生長的菌落大小、形態特征、指示劑反應情況等應與對照培養基一致。

                      液體培養基指示能力檢查

                      分別接種不大于100cfu的試驗菌(表2)于被檢培養基和對照培養基中,在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養。與對照培養基管比較,被檢培養基管試驗菌生長情況、指示劑反應等應與對照培養基一致。

                      驗證

                      當建立產品的微生物限度檢查法時,應進行控制菌檢查方法的驗證,以確認所采用的方法適合于該產品的控制菌檢查。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時,檢查方法應重新驗證。

                      驗證時,依各品種項下微生物限度標準中規定檢查的控制菌選擇相應驗證的菌株,驗證大腸菌群檢查法時,采用大腸埃希菌作為驗證菌株。驗證試驗按供試液的制備和控制菌檢查法的規定及下列要求進行。

                      菌種及菌液制備

                      同控制菌檢查用培養基的適用性檢查。

                      驗證方法

                      取規定量供試液及10~100cfu試驗菌加入增菌培養基中,依相應控制菌檢查法進行檢查。當采用薄膜過濾法時.取規定量供試液,過濾,沖洗,試驗菌應加在最后一次沖洗液中,過濾后,注入增菌培養荃或取出濾膜接人增菌培養基中。

                      結果判斷

                      若上述試驗檢出試驗菌,按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查;若未檢出試驗菌,應采用培養基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,并重新進行方法驗證。

                      驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。

                      供試品檢查

                      供試品的控制菌檢查應按已驗證的方法進行。

                      陽性對照試驗

                      陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查,對照菌的加菌量為10~10Ocfu。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。

                      陰性對照試驗

                      取稀釋液10ml照相應控制菌檢查法檢查,作為陰性對照。陰性對照應無菌生長,

                      1)大腸埃希菌(Escherichia coli)取供試液10ml(相當于供試品lg、lml、10cm2),直接或處理后接種至適量(不少于100ml)的膽鹽乳糖培養基中,培養18~24小時,必要時可延長至48小時。

                      取上述培養物0.2ml,接種至含5ml MUG培養基的試管內,培養,于5小時、24小時在366nm紫外光下觀察,同時用未接種的MUG培養基作本底對照。若管內培養物呈現熒光,為MUG陽性;不呈現熒光,為MUG陰性。觀察后,沿培養管的管壁加人數滴靛基質試液,液面呈玫瑰紅色,為靛基質陽性;呈試劑本色,為靛基質陰性。本底對照應為MUG陰性和靛基質陰性。

                      MUG陽性、靛基質陽性,判供試品檢出大腸埃希菌;如MUG陰性、靛基質陰性,判供試品未檢出大腸埃希菌;如MUG陽性、靛基質陰性,或MUG陰性、靛基質陽性,則應取膽鹽乳糖培養基的培養物劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養基的平板上,培養18~24小時。

                      若平板上無菌落生長或生長的菌落與表3所列的菌落形態特征不符,判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落與表3所列的菌落形態特征相符或疑似,應進行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗,確認是否為大腸埃希菌。

                      3 大腸埃希菌菌落形態特征

                      培養基

                      菌落形態

                      曙紅亞甲藍瓊脂

                      紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色,菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心,圓形,稍凸起,邊緣整齊,表面光滑,濕潤,常有金屬光澤

                      麥康凱瓊脂

                      鮮桃紅色或微紅色,菌落中心呈深桃紅色,圓形,扁平,邊緣整齊,表面光滑,濕潤

                      2)大腸菌群Coliform)取含適量(不少于10ml )的乳糖膽鹽發酵培養基3支,分別加入1 :10的供試液lml(含供試品0.1g或0.1ml)、1: 100的供試液1ml(含供試品0.01g或0.01ml)、1:1000的供試液1 ml(含供試品0.001g或0.001ml),另取1支乳糖膽鹽發酵培養基管加人稀釋液1ml作為陰性對照管。培養18~24小時。

                      乳糖膽鹽發酵管若無菌生長或有菌生長但不產酸產氣,判該管未檢出大腸菌群;若產酸產氣,應將發酵管中的培養物分別劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養基或麥康凱瓊脂培養墓的平板上,培養18~24小時。

                      若平板上無菌落生長,或生長的菌落與表4所列的菌落形態特征不符或為非革蘭氏陰性無芽抱桿菌,判該管未檢出大腸菌群;若平板上生長的菌落與表4所列的菌落形態特征相符或疑似,且為革蘭氏陰性無芽抱桿菌,應進行確證試驗。

                      4 大腸菌群菌落形態特征

                      培養基

                      菌落形態

                      曙紅亞甲藍瓊脂

                      紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色,圓形,扁平或稍凸起,邊緣整齊.表面光滑,濕潤

                      麥康凱瓊脂

                      鮮桃紅色或粉紅色,圓形,扁平或稍凸起,邊緣整齊,表面光滑,濕潤

                      確證試驗從上述分離平板上挑選4~5個疑似菌落,分別接種于乳糖發酵管中,培養24~48小時。若產酸產氣,判該乳糖膽鹽發醉管檢出大腸菌群,否則判未檢出大腸菌群。

                      根據大腸菌群的檢出管數,按表5報告lg或lml供試品中的大腸菌群數。

                      5 可能的大腸菌群數

                      各供試品量的檢出結果

                      可能的大腸菌群數N(個/g或ml )

                      0.1g或0.1ml

                      0.01g或0.01ml

                      0.01g或0.01ml

                      +

                      +

                      +

                      > 103

                      +

                      +

                       

                      102< N < 103

                      +

                      10 < N < 102

                      < 10

                      注:+代表檢出大腸菌群;代表未檢出大腸菌群.

                      3)沙門菌salmonella)取供試品10g或10ml ,直接或處理后接種至適量(不少于200ml)的營養肉湯培養基中,用勻漿儀或其他適宜方法混勻,培養18~24小時。

                      取上述培養物1ml,接種于10 ml四硫磺酸鈉亮綠培養基中,培養18~24小時后,分別劃線接種膽鹽硫乳瓊脂(或沙門、志賀菌屬瓊脂)培養基和麥康凱瓊脂(或曙紅亞甲藍瓊脂)培養基的平板上,培養18~24小時(必要時延長至40~48小時)。若平板上無菌落生長或生長的菌落不同于表6所列的特征,判供試品未檢出沙門菌。

                      若平板上生長的菌落與表6所列的菌落形態特征相符或疑似,用接種針挑選2~3個菌落分別于三糖鐵瓊脂培養基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種,培養18~24小時,如斜面未見紅色、底層未見黃色;或斜面黃色、底層無黑色,判供試品未檢出沙門菌。否則,應取三糖鐵瓊脂培養基斜面的培養物進行適宜的鑒定試驗,確認是否為沙門菌。

                      6 沙門菌菌落形態特征

                      培養基

                      菌落形態

                      膽鹽硫乳瓊脂

                      無色至淺橙色,半透明,菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色

                      沙門、志賀菌屬瓊脂

                      無色至淡紅色,半透明或不透明,菌落中心有時帶黑褐色

                      曙紅亞甲藍瓊脂

                      無色至淺橙色.透明或半透明,光滑濕潤的圓形菌落

                      麥康凱瓊脂

                      無色至淺橙色,透明或半透明,菌落中心有時為暗色

                      4)銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa)取供試液10ml(相當于供試品1g、lml、10cm2),直接或處理后接種至適量(不少于100ml)的膽鹽乳糖培養基中,培養18~24小時。取上述培養物,劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基的平板上,培養18~24小時。

                      銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴散、表面濕潤,灰白色,周圍時有藍綠色素擴散。如平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態特征不符,判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板生長的菌落與上述菌落形態特征相符或疑似,應挑選2~3個菌落,分別接種于營養瓊脂培養基斜面上,培養18~24小時。取斜面培養物進行革蘭氏染色、鏡檢及氧化酶試驗。

                      氧化酶試驗

                      取潔凈濾紙片置于平皿內,用無菌玻棒取斜面培養物涂于濾紙片上,滴加新配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液,在30秒內若培養物呈粉紅色并逐漸變為紫紅色為氧化酶試驗陽性,否則為陰性。

                      若斜面培養物為非革蘭氏陰性無芽抱桿菌或氧化酶試驗陰性,均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則,應進行綠膿菌素試驗。

                      綠膿菌素(Pyocyanin)試驗

                      斜面培養物接種于PDP瓊脂培養基斜面上,培養24小時,加三氯甲烷3~5ml至培養管中,攪碎培養基并充分振搖。靜置片刻,將三氯甲烷相移至另一試管中,加人lmol / L鹽酸試液約lml,振搖后,靜置片刻,觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色,為綠膿菌素試驗陽性,否則為陰性。同時用未接種的PDP瓊脂培養基斜面同法作陰性對照,陰性對照試驗應呈陰性。

                      若上述疑似菌為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陽性,判供試品槍出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陰性,應繼續進行適宜的鑒定試驗,確認是否為銅綠假單胞菌。

                      ( 5 )金黃色葡萄球菌StapHylococcus aureus)取供試液l0ml(相當于供試品1g、lml、l0cm2),直接或處理后接種至適見(不少于100ml)的亞碲酸鈉(鉀)肉湯(或營養肉湯)培養基中,培養18~24小時,必要時可延長至48小時。取上述培養物,劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養基的平板上,培養24~72小時。若平板上無菌落生長或生長的菌落不同于表7所列特征,判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。

                      7 金黃色葡萄球菌菌落形態特征

                      培養基

                      菌落形態

                      甘露醇氯化鈉瓊脂

                      金黃色,圓形凸起,邊緣整齊,外圍有黃色環,菌落直徑0.7~lmm

                      卵黃氯化鈉瓊脂

                      金黃色,圓形凸起,邊緣整齊,外圍有卵磷脂分解的乳濁圈,菌落直徑1~2mm

                      若平板上生長的菌落與表7所列的菌落特征相符或疑似,應挑選2~3個菌落,分別接種于營養瓊脂培養基斜面上,培養18~24小時。取營養瓊脂培養基的培養物進行革蘭氏染色.并接種于營養肉湯培養基中,培養18~24小時,做血漿凝固酶試驗。

                      血漿凝固酶試驗

                      取滅菌小試管3支,各加入血漿和無菌水混合液(1 : 1 ) 0.5ml,再分別加入可疑菌株的營養肉湯培養物(或由營養瓊脂培養基斜面培養物制備的濃菌懸液)0.5ml、金黃色葡萄球菌營養肉湯培養物(或由營養瓊脂培養基斜面培養物制備的濃菌懸液)0.5ml、營養肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml ,即為試驗管、陽性對照管和陰性對照管。將3管同時培養,3小時后開始觀察直至24小時。陰性對照管的血漿應流動自如,陽性對照管血漿應凝固,若試驗管血漿凝固為血漿凝固酶試驗陽性,否則為陰性。如陽性對照管或陰性對照管不符合規定時,應另制備血漿,重新試驗。

                      若上述疑似菌為非革蘭氏陽性球菌、血漿凝固酶試驗陰性,判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。

                      ( 6 )梭菌(Clostridium)取供試液10ml(相當于供試品1g、lml、10cm2) 2份,其中l份置80 ℃保溫10分鐘后迅速冷卻。上述2份供試液直接或處理后分別接種至100ml的梭菌增菌培養基中。置厭氧條件下培養48小時。取上述每一培養物0.2ml,分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養基平板上,置厭氧條件下培養48~72小時。若平板上無菌落生長,判供試品未檢出梭菌;若平板上有菌落生長,應挑選2~3個菌落分別進行革蘭氏染色過氧化氫酶試驗。

                      過氧化氫酶試驗

                      取七述平板上的菌落,置潔凈玻片上,滴加3%過氧化氫試液,若菌落表面有氣泡產生,為過氧化氫酶試驗陽性,否則為陰性。

                      若上述可疑菌落為革蘭氏陽性梭菌,有或無卵圓形或球形的芽孢,過氧化氫酶試驗陰性,判供試品檢出梭菌,否則判供試品未檢出梭菌。

                      ( 7 )白色念珠菌Candida albicans)取供試液10ml(相當于供試品1g、lml、l0cm2)直接或處理后接種至適量(不少于100ml)的沙氏葡萄糖液體培養基中,培養48~72小時。取上述培養物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上,培養24~48小時(必要時延長至72小時)。

                      白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的菌落呈乳白色,偶見淡黃色,表面光滑有濃酵母氣味,培養時間稍久則菌落增大,顏色變深、質地變硬或有皺褶。若平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態特征不符,判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上生長的菌落與上述菌落形態特征相符或疑似,應挑選2~3個菌落分別接種至念珠菌顯色培養基平板上 ,培養24~48小時(必要時延長至72小時)。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長,判供試品未檢出白色念珠菌。

                      若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色.挑取相符或疑似的菌落接種于1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基上.培養24~48小時。取培養物進行染色、鏡檢及芽管試驗。

                      芽管試驗

                      挑取l%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基上的培養物,接種于加有一滴血清的載玻片上,蓋上蓋玻片,置濕潤的平皿內,于35~37 ℃培養1~3小時,置顯微鏡下觀察孢子上有否長出短小芽管。

                      若上述疑似菌為非革蘭氏陽性菌,顯微鏡下未見厚膜孢子、假菌絲、芽管,判供試品未檢出白色念珠菌。

                      結果判斷

                      供試品檢出控制菌或其他致病菌時,按一次檢出結果為準,不再復試。

                      供試品的細菌數、霉菌和酵母菌數其中任何一項不符合該品種項下的規定,應從同一批樣品中隨機抽樣,獨立復試兩次,以3次結果的平均值報告菌數。

                      若供試品的細菌數、霉菌和酵母菌數及控制菌三項檢驗結果均符合該品種項下的規定,判供試品符合規定;若其中任何一項不符合該品種項下的規定.判供試品不符合規定。

                      制備方法

                      稀釋液

                      稀釋液配制后,應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。

                      1 .pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液

                      無菌檢查法(附錄XII A)制備。

                      2.pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液

                      緩沖液(二部附錄XV D)配制后,過濾,分裝,滅菌。

                      如需要,可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加入表面活性劑中和劑等。

                      3.0.9%無菌氯化鈉溶液

                      取氯化鈉9.0g,加水溶解使成1000ml,過濾,分裝,滅菌。

                      培養基制備

                      培養基可按以下處方制備,也可使用按該處方生產的符合要求的脫水培養基。配制后,應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。

                      1.營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基及改良馬丁瓊脂培養基

                      無菌檢查法(附錄XII A)制備。

                      2.玫瑰紅鈉瓊脂培養基

                       5.0g

                      玫瑰紅鈉 0.0133g

                      葡萄糖 10.0g

                      瓊脂 14.0g

                      磷酸二氫鉀 1.0g

                       1000ml

                      硫酸鎂 0.5g

                      除葡萄糖、玫瑰紅鈉外,取上述成分,混合,微溫溶解,濾過,加入葡萄糖、玫瑰紅鈉,分裝.滅菌。

                      3.酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基(YPD )

                       10.0g

                      瓊脂 14.0g

                      酵母浸出粉 5.0g

                       1000ml

                      葡萄糖 20.0g

                      除葡萄糖外,取上述成分.混合,微溫溶解,濾過,加人葡萄糖,分裝.滅菌。

                      4.膽鹽乳糖培養基(BL )

                      20.0g

                      磷酸二氫鉀 1.3g

                      乳糖 5.0g

                      牛膽鹽 2.0g

                      氯化鈉 5.0g

                      (或去氧膽酸鈉) ( 0.5g)

                      磷酸氫二鉀 4.0g

                       1000ml

                      除乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉外,取上述成分,混合,微溫溶解,調節pH值使滅菌后為7.4 ±0.2,煮沸,濾清,加人乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉,分裝,滅菌。

                      5.乳糖膽鹽發酵培養基

                       20.0g

                      0.04%溴甲酚紫指示液 25ml

                      乳糖 10.0g

                       l000ml

                      牛膽鹽 5.0g

                      0.04%溴甲酚紫指示液外,取上述成分,混合,微溫溶解,調節pH值使滅菌后為7.4 ±0.2,加人0.04%溴甲酚紫指示液,根據要求的用量分裝于含倒管的試管中。滅菌。所用倒管的規格應保證產氣結果的觀察。

                      6.曙紅亞甲藍瓊脂培養基(EMB )

                      營養瓊脂培養基 100ml

                      曙紅鈉指示液 2ml

                      20%乳糖溶液 5ml

                      亞甲藍指示液 1.3~1.6ml

                      取營養瓊脂培養基,加熱溶化后,冷至60℃,按無菌操作加入滅菌的其他3種溶液,搖勻,傾注平皿。

                      7.麥康凱瓊脂培養基(MacC)

                      20.0g

                      1%中性紅指示液 3ml

                      乳糖 10.0g

                      瓊脂 14.0g

                      牛膽鹽 5.0g

                       l000ml

                      氯化鈉 5.0g

                      乳糖、1%中性紅指示液、牛膽鹽及瓊脂外,取上述成分,混合,微溫溶解,調節pH值使滅菌后為7.2 ±0.2,加入瓊脂,加熱溶化后,再加入其余各成分,搖勻,分裝,滅菌,冷至約60℃,傾注平皿。

                      8.4 -甲基傘形酮葡糖昔酸(4-methylumbelliferyl-β-D-glucuionide,MUG)培養基

                       10.0g

                      磷酸二氫鉀(無水) 0.9g

                      硫酸錳 0.5mg

                      磷酸氫二鈉(無水) 6.2g

                      硫酸鋅 0.5mg

                      亞硫酸鈉 40mg

                      硫酸鎂 0.1g

                      去氧膽酸 1.0g

                      氯化鈉 5.0g

                      MUG 75mg

                      氯化鈣 50mg

                       l000ml

                      MUG外,取上述成分,混合,微溫溶解,調節pH值使滅菌后為7.3±0.1,加人MUG,溶解,每管分裝5ml,滅菌。

                      9.三糖鐵瓊脂培養基(TSI )

                       20.0g

                      牛肉浸出粉 5.0g

                      乳糖 10.0g

                      蔗糖 10.0g

                      葡萄糖 1.0g

                      氯化鈉 5.0g

                      硫酸亞鐵 0.2g

                      硫代硫酸鈉 0.2g

                      0.2%酚磺酞指示液 12.5ml

                      瓊脂 12.0g

                       1000ml

                      除三種糖、0.2%酚磺酞指示液、瓊脂外,取上述成分,混合,微溫溶解,調節pH值使滅菌后為7.3±0.1,加入瓊脂,加熱溶化后,再加入其余各成分,搖勻,分裝,滅菌,制成高底層(2~75px)短斜面。

                      10.四硫磺酸鈉亮綠培養基(TTB)

                       5.0g

                      硫代硫酸鈉 30.0g

                      牛膽鹽 1.0g

                       l000ml

                      碳酸鈣 10.0g

                      取上述成分,混合,微溫溶解,滅菌。

                      臨用前,取上述培養基,每10ml加入碘試液0.2ml和亮綠試液0.lml,混勻。

                      11.沙門、志賀菌屬瓊脂培養基(SS)

                       5.0g

                      硫代硫酸鈉 8.5g

                      牛肉浸出粉 5.0g

                      中性紅指示液 2.5ml

                      乳糖 10.0g

                      亮綠試液 0.33ml

                      牛膽鹽 8.5g

                      瓊脂 16.0g

                      枸櫞酸鈉 8.5g

                       1000ml

                      枸櫞酸鐵銨 1.0g

                      除乳糖、中性紅指示液、瓊脂外,取上述成分,混合,微溫溶解,調節pH值使滅菌后為7.2±0.1,濾過,加入瓊脂,加熱溶化后,再加入其余各成分,搖勻,滅菌,冷至60℃,傾注平皿。

                      12.膽鹽硫乳瓊脂培養基(DHL )

                       20.0g

                      枸櫞酸鈉 1.0g

                      牛肉浸出 3.0g

                      枸櫞酸鐵銨 1.0g

                      乳糖 10.0g

                      中性紅指示液 3ml

                      蔗糖 10.0g

                      瓊脂 16.0g

                      去氧膽酸 1.0g

                       l000ml

                      硫代硫酸鈉 2.3g

                      除糖、指示液及瓊脂外,取上述成分,混合,微溫溶解,調節pH值使滅菌后為7.2±0.1,加入瓊脂,加熱溶化后,再加人其余成分,搖勻,冷至60 ℃,傾注平皿。

                      13.溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基

                       10.0g

                      溴化十六烷基三甲銨 0.3g

                      牛肉浸出粉 3.0g

                      瓊脂 14.0g

                      氯化鈉 5.0g

                       l000ml

                      除瓊脂外,取上述成分,混合,微溫溶解,調節pH值使滅菌后為7.5±0.1,加入瓊脂,加熱溶化后,分裝,滅菌,冷至60 ℃,傾注平皿。

                      14.亞碲酸鹽肉湯培養基

                      臨用前,取滅菌的營養肉湯培養基,每100ml中加人新配制的1%亞諦酸鈉(鉀)試液0.2ml,混勻,即得。

                      15.卵黃氯化鈉瓊脂培養基

                       6.0g

                      10%氯化鈉卵黃液 100ml

                      牛肉浸出粉 1.8g

                      瓊脂 14.0g

                      氯化鈉 30.0g

                       650ml

                      10 %氯化鈉卵黃液外,取上述成分,混合,微溫溶解,調節pH值使滅菌后為7.6土0 .1,滅菌,待冷至約60 ℃,以無菌操作加入10%氯化鈉卵黃液,充分振搖,傾注平皿。

                      10%氯化鈉卵黃液的制備取新鮮雞蛋1個,以無菌操作取出卵黃,放入10%無菌氯化鈉溶液100ml中,充分振搖,即得。

                      16.甘露醇氯化鈉瓊脂培養基

                       10.0g

                      酚磺酞指示液 2.5ml

                      牛肉浸出粉 1.0g

                      瓊脂 14.0g

                      甘露醇 10.0g

                       l000ml

                      氯化鈉 75.0g

                      除甘露醇、酚磺酞指示液及瓊脂外,取上述成分,混合,微溫溶解,調節州值使滅菌后為7.4 ±0.2,加入瓊脂,加熱溶化后,濾過,分裝,滅菌,冷至60 ℃,傾注平皿。

                      17.乳糖發酵培養基

                       20.0g

                      乳糖 10.0g

                      0.04%溴甲酚紫指示液 25ml

                       l000ml

                      0.04%溴甲酚紫指示液外,取上述成分,混合,微溫溶解,調節pH值使滅菌后為7.2±0.2,加入指示液,分裝于含倒管的小試管中,每管3ml.滅菌。

                      18.綠膿菌素Pyocyanin)測定用培養基(PDP瓊脂培養基)

                       20.0g

                      甘油 l0ml

                      氯化鎂(無水) 1.4g

                      瓊脂 14.0g

                      硫酸鉀(無水) 10.0g

                       1000ml

                      取胨、氯化鎂、硫酸鉀和水混合,微溫溶解,調節pH值使滅菌后為7.3±0.1,加入甘油及瓊脂,加熱溶化,混勻,分裝于試管,滅菌,置成斜面。

                      19.梭菌增菌培養基

                      牛肉浸出粉 10.0g

                      鹽酸半胱氨酸 0.5g

                       10.0g

                      氯化鈉 5.0g

                      酵母浸出粉 3.0g

                      醋酸鈉 3.0g

                      可溶性淀粉 1.0g

                      瓊脂 0.5g

                      葡萄糖 5.0g

                       1000ml

                      取上述成分,混合,加熱煮沸使溶解,調節pH值使滅菌后為6.8士0.2,加熱溶化,濾過,分裝,滅菌。

                      20.哥倫比亞瓊脂培養基

                      酪蛋白胰酶消化物 10.0g

                      肉胃酶消化物 5.0g

                      心胰酶消化物 3.0g

                      酵母浸出粉 5.0g

                      玉米淀粉 1.0g

                      氯化鈉 5.0g

                      瓊脂 15.0g

                       1000ml

                      除瓊脂外,取上述成分,混合,微溫溶解,調節pH值使滅菌后為7.3士0.2,加入瓊脂,加熱溶化,濾過,分裝,滅菌,冷至45~50 ℃,加人相當于20mg慶大霉素的無菌硫酸慶大霉素,混勻,傾注平皿。

                      21.沙氏葡萄糖液體培養基

                       10g

                      葡萄糖 40g

                       1000ml

                      除葡萄糖外,取上述成分,混合,微溫溶解,濾過。加人葡萄糖,溶解,分裝,滅菌。

                      22.沙氏葡萄糖瓊脂培養基

                       10g

                       1000ml

                      葡萄糖 40g

                      瓊脂 14g

                      除瓊脂和葡萄糖外,混合,微溫溶解,濾過。加入瓊脂和葡萄糖,溶解,分裝,滅菌。

                      23.(科瑪嘉)念珠菌顯色培養基(注1)

                       10.2g

                      瓊脂 15g

                      氫罌素 0.5g

                      滅菌水 1000ml

                      色素 22.0g

                      除瓊脂外,取上述成分,混合,微溫溶解,調節pH值至6.3士0.2。濾過,加入瓊脂,加熱煮沸,不斷攪拌至瓊脂完全溶解,傾注平皿。

                      24.1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養基

                      黃色玉米粉 40g

                      瓊脂 10~15g

                      聚山梨酯80 10ml

                       1000ml

                      玉米粉、聚山梨酯80及蒸餾水500ml,混合,65℃加熱30分鐘,混勻,用紗布濾過,補足原水量。取瓊脂,水500ml,混合,加熱溶解。將以上兩種溶液混合,搖勻,分裝,滅菌。

                      微生物限度

                      非無菌藥品的微生物限度標準是基于藥品的給藥途徑及對患者健康潛在的危害而制訂的。藥品的生產、貯存、銷售過程中的檢驗,原料及輔料的檢驗,新藥標準制訂,進口藥品標準復核,考察藥品質量及仲裁等,除另有規定外,其微生物限度均以本標準為依據。

                      制劑通則品種

                      制劑通則、品種項下要求無菌的制劑及標示無菌的制劑應符合無菌檢查法規定。

                      口服給藥制劑

                      細菌數每1g不得過l000cfu。每lml不得過100cfu。

                      霉菌和酵母菌數每lg或lml不得過100cfu。

                      大腸埃希菌每1g或lml不得檢出.

                      局部給藥制劑

                      3.1用于手術、燒傷及嚴重創傷的局部給藥制劑應符合無菌檢查法規定。

                      3.2耳、鼻及呼吸道吸入給藥制劑

                      細菌數每1g、lml或l0cm2,不得過100cfu。

                      霉菌和酵母菌數每1g、lml或l0cm2,不得過10cfu。

                      金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌1g、lml或l0cm2不得檢出。

                      大腸埃希菌鼻及呼吸道給藥的制劑,每1g、lml或l0cm2,不得檢出。

                      3.3陰道、尿道給藥制劑

                      細菌數每1g、lml或l0cm2,不得過100cfu。

                      霉菌數和酵母菌數每1g、lml或l0cm2應小于10cfu。

                      金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌1g、lml或l0cm2,不得檢出。

                      3 .4直腸給藥制劑

                      細菌數每1g不得過l000cfu。每lml不得過100cfu。

                      霉菌和酵母菌數每1g或lml不得過100cfu。

                      金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌lg或lml不得檢出。

                      3.5其他局部給藥制劑

                      細菌數每1g、lml或l0cm2不得過100cfu。

                      霉菌和酵母菌數每1g、lml或l0cm2不得過100cfu。

                      金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌每1g、lml或l0cm2不得檢出。

                      含動物組織

                      含動物組織(包括提取物)的口服給藥制劑10g或10ml還不得檢出沙門菌。

                      兼用途徑制劑

                      應符合各給藥途徑的標準。

                      霉變長螨者

                      以不合格論。

                      原料及輔料

                      參照相應制劑的微生物限度標準執行。

                      1:本檢查法中白色念珠菌檢查所描述該菌在念珠菌顯色培養基上的菌落特征,是指該菌在法國科瑪嘉公司提供的科瑪嘉念珠菌顯色培養基上生長的菌落特征。給出這一信息是為了方便本方法的使用者,并不表示對該公司產品的認可.若其他等效產品具有相同的效果,那么也可使用其他等效的產品。 [1]

                      以上文中方法中提到的無菌檢查法(附錄XII A)”為《中國藥典》2010版二部附錄XII A無菌檢查法。

                       

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